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超全熒光定量PCR應用常見問題匯總!


實時熒光定量技術是什么

20世界90年代由美國Applied Biosystems公司推出實時熒光定量PCR技術(Real-time qPCR),其基本原理是在常規PCR基礎上添加熒光染料或熒光染料探針,利用熒光信號積累實時監測整個PCR過程。熒光定量PCR最大的優勢可以對初始模板進行定量,目前已廣泛應用于生命科學、醫學研究等領域。


常見問題羅列

沒有CT值

實驗結果一旦遇到沒有Ct值情況,就要在第一時間排查是否有以下問題:


(1)循環數不夠(但是一般不超過45循環,不僅背景值提高,定量也不準);

(2)PCR程序設置不對,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

(3)引物或探針降解?赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

(4)模板量可能降解或上樣量不足(但一般不超過500ng,根據試劑盒說明書即可),對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發生模板降解,應考慮樣品準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣品小量分裝儲備,避免反復凍融;

(5)引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

CT值過晚

在相對定量中,Ct值一般控制在15~25之間比較好,如果在絕對定量中,對低拷貝數的樣品,Ct值會增大,但是一般不宜超過40循環,否則定量不準確。因此,判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況,需要根據具體實驗設計和目的進行。


(1)擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適,需要進行優化;引物或探針設計不合理,需要重新設計;

(2)PCR程序不合適,改用三步法進行反應,或者優化退火/延伸溫度,可以適當降低退火溫度;退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

(3)MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

(4)PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

(5)模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。


標準曲線線性關系不佳

如果遇到標準曲線線性關系不佳R2<0.9的情況,那么很有可能是以下環節存在問題:


(1)標準品稀釋或者加樣存在誤差,吸樣不準,使得標準品不呈梯度;


(2)標準品出現降解。應避免標準品反復凍融,將高濃度DNA模板分裝,保存于-20℃或-80℃,不要反復凍融,現配現用;


(3)引物或探針不佳。重新設計更好更穩定的引物或探針;


(4)模板中存在抑制物。模板濃度過高,根據現有商品化熒光定量試劑盒的要求,一般模板量不超過500ng,以50~500ng為宜。

陰性對照擴增有信號

如果陰性對照擴增有信號,首先排查各操作環節是否有不當,造成交叉污染:


(1)引物設計不夠優化。應避免引物二聚體和發夾結構的出現。


(2)引物濃度不佳。適當降低引物濃度,并注意上下游引物的濃度配比。


(3)鎂離子濃度過高。適當降低鎂離子濃度,或選擇更適合的mix試劑盒。


(4)模板有基因組的污染。RNA提取過程中避免基因組DNA的引入,或通過引物設計避免非特異性擴增。


(5)交叉污染。在所用的試劑中有交叉污染,或操作環境中有氣溶膠造成污染,建議對操作環境進行處理,或者更換新的環境、加樣器、槍頭以及所有的引物、試劑等。


熔解曲線峰不特異

如果熔解曲線峰不特異,那么很有可能是以下環節存在問題:


(1)引物設計不夠優化。應避免引物二聚體和發夾結構的出現,這是最主要因素;引物濃度不佳,尤其是涉及二聚體存在時,適當降低引物濃度,并注意上下游引物的濃度比例;


(2)離子濃度不合適。適當降低鎂離子濃度,或選擇更適合的mix試劑盒,不同試劑盒在該方面的優化能力不適合,有些情況下可以通過更換試劑盒改善結果;


(3)模板有基因組污染。RNA提取過程中避免基因組DNA的引入,或通過引物設計避免非特異性擴增。

擴增效率低

該情況適用于針對所有的基因,特別是內參基因仍無法獲得較好的擴增信號時,應考慮如下情況:


(1)反應試劑中部分成分比例是否最佳,另外考慮熒光染料是否降解;


(2)反應條件不夠優化?蛇m當降低退火溫度或改為三步擴增法,適當延長變性退火時間;


(3)反應體系中有PCR反應抑制物。一般是加入模板時所引入的,應先把模板適度稀釋,再加入反應體系,減少抑制物的影響。

擴增曲線的異常

如果遇到擴增曲線異常,比如“S”型曲線等等情況,那么很有可能是以下環節存在問題:


(1)模板的濃度太高或者降解;

(2)熒光染料的降解;

(3)在操作熒光定量PCR時,帶上新的一次性手套,蓋上避免任何指紋或者字跡等;

(4)液體揮發。耗材氣密性等問題引起液體蒸發,沒有很好的聚集在管子里;

(5)氣泡。操作問題如移液槍加樣引起的氣泡問題。


參考文獻:

Troubleshooting Guide for qPCR and RT qPCR kits (EUROGENTEC)


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