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干貨分享 | 熱啟動酶耐熱機制全面解析

常規PCR技術因能夠快速擴增任何已知的DNA片段而被廣泛應用于分子生物學的各個領域。但常規型PCR技術容易出現引物二聚體或錯配引起的非特異性擴增等現象,造成實驗結果的不準確性。熱啟動型PCR能夠很好的解決上述問題,是最常用的提高PCR特異性的方法。


熱啟動酶(Hot start enzyme主要利用酶的修飾物在常溫下抑制DNA聚合酶的活性,加熱至變性溫度時修飾物失活,釋放酶活,從而使PCR反應得以正常進行。目前市面上常用的DNA聚合酶熱啟動修飾方法主要有化學修飾、配體修飾抗體修飾等,不同的熱啟動修飾方法原理上有所區別,各有優劣勢。


化學法

DNA聚合酶的化學法修飾,一般采用化學小分子如酸酐等有機物與聚合酶上的側鏈氨基酸(賴氨酸)通過化學反應相互作用,使酶低溫時失去酶活,溫度升高后,酸酐與氨基之間的化學鍵斷裂,酶活釋放,從而達到熱啟動效果。化學修飾可有效封閉酶的活性,操作簡單,但酶活性釋放速度較慢,依賴溫度激活DNA聚合酶,能有效抑制非特異性產物,可在室溫下配置反應體系,且對PCR反應buffer要求較高。

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1. 化學法修飾熱啟動酶原理圖


配體法

配體法修飾,主要借助核酸適配體封閉酶活。顧名思義,核酸適配體一般指一類具有特異性識別功能的單鏈核酸分子,可以是RNA也可以是DNA,長度一般為25~60個核苷酸。作為一種寡核甘酸序列的識別分子,作用的靶分子范圍廣泛,從無機金屬的小分子到生物領域的大分子。這些適配子可以形成特定的空間構象,從而在表觀功能上與抗體類似。對蛋白質或其他小分子物質具有高度特異性、親和力。核酸適配體通過非共價鍵與DNA聚合酶結合,進而抑制聚合酶在非許可溫度下的聚合反應。一般核酸適配體的篩選所需周期較短,整個過程能夠依賴自動化,簡便快捷。

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2. 配體法修飾熱啟動酶原理圖


抗體法

抗體法熱啟動酶一般考慮使用DNA聚合酶抗體封閉酶活性,使其在低溫時處于無活性狀態,在加熱至變性溫度時抗體變性,解除封閉從而釋放活性,可以大大避免錯配或引物二聚體引起的非特異性擴增。另一方面針對低豐度基因,封閉抗體在避免預變性前的DNA聚合酶和模板的非特異性結合的同時,增加了引物與微量的正確模板碰撞退火的效率,從而保證低豐度基因的有效檢出,大大提升反應靈敏度和擴增效率。

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3. 抗體法修飾熱啟動酶原理圖


1. 熱啟動酶常見修飾方法優劣勢比較

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以上簡單介紹了熱啟動酶的常見類別和各種熱啟動方法的優劣勢,其中化學修飾物不能夠批量合成,而且需要較長的激活時間聚合酶才能釋放酶活。配體修飾DNA聚合酶只在20-25°C效果較好,到40°C時,聚合酶的活性就被釋放出來,特異性不好;而抗體法修飾熱啟動酶對應的封閉效果最佳,酶活釋放速度快,從而大大降低PCR反應時間,是目前IVD市場上應用較多的一種熱啟動酶改造方法。


熱啟動酶在熱啟動PCR的應用方面較為廣泛,不僅有效防止非特異性PCR產物,而且在較難擴增的PCR反應如單拷貝基因的擴增、多重PCR和超長片段的擴增等應用尤為突出,大大改觀了傳統PCR技術的局限性。在病原微生物檢測、遺傳病診斷和法醫鑒定等各個領域等實際應用中頗為廣泛。



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