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PCR儀,你選對了嗎?

眾所周知,不同型號和生產廠商的PCR儀可能會展現出不同的性能和可重復性。 這些不同不僅會影響PCR效率也會對獲取數據的準確性和一致性造成影響。 過度使用的PCR儀的可靠性,以及當問題出現時可提供的支持,都是在進行PCR儀選擇時需要考慮的重要方面。 因此,了解可影響PCR結果的PCR儀特點可幫助我們最大程度實現實驗的成功。 今天,小編為您整理了六大貼士,解決大家的困擾!

 

1. 加熱模塊之間準確而一致的溫度

 

PCR儀溫度的準確性可能會對PCR的成敗與否起決定性作用,因為PCR的三個主要步驟都依賴于溫度。 類似地,加熱模塊上孔與孔之間的溫度一致性對于獲取可靠而可重復的PCR結果也是至關重要的。 

 

因此,所使用的PCR儀能在模塊之間準確到達設定的溫度并具有一致性十分關鍵。

 

確保熱準確性的一種方法就是經常使用溫度驗證試劑盒進行檢測(圖1)并根據需要由接受過培訓的專業人士進行重新校準。 溫度驗證檢測通?捎糜冢

 

  • 在等溫模式下相對于設定溫度的孔間準確性

  • 在溫度轉換后相對于設定溫度的孔間準確性

  • 熱蓋溫度的準確性(可影響模塊和樣品溫度)

 

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圖 1. 使用溫度驗證試劑盒進行模塊和熱蓋溫度的測量



2. 用于引物退火優化的精確溫度控制

 

梯度溫度控制是PCR儀一項可有助于PCR中引物退火優化的功能。 梯度設定的目的是在模塊之間實現變化的溫度,通過每列之間≥2°C的間隔溫度升降,使得可同時對于一系列的溫度進行測試以獲取最佳的引物退火溫度(圖2A)。理論上,真正的梯度可在模塊之間實現線性的溫度(圖2B)。 

 然而,傳統梯度PCR儀通常只采用單一的熱模塊并通過位于兩端的兩個加熱及冷卻元件進行溫度的控制。 該設計經常會導致以下限制:

 

  • 僅能設置兩個溫度:在熱模塊的兩端設置成引物退火的高、低極限溫度(圖2A)。 因此,無法在模塊間實現其他溫度的精準設置。

  • 由于不同列之間的熱交換,模塊上不同區域之間的溫度更可能遵循的是S形的曲線變化而非真正的線性梯度(圖2B)。

 

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圖 2. 梯度溫度設置 (A) 因為加熱模塊的設計,僅能設置兩個溫度:在熱模塊的兩端設置成引物退火的高、低極限溫度。 兩個溫度點的設置是基于計算出來的退火溫度(Tm)和不同列之間期望實現的溫度差異。 (B) 理論值(真正的梯度) vs. 梯度熱模塊上實際測量得到的溫度。

 

具有“better-than-gradient”技術的PCR儀可實現更好的引物退火溫度控制[5]。 該技術的一種形式便是設計帶有三個或更多分割金屬模塊的PCR儀,每一模塊都具有獨立的加熱和冷卻元件。 相比于梯度模塊,該模塊設計可帶來:

 

  • 獨立設置三種或更多不同溫度的能力,以便使得每個獨立的區域都能進行更好的溫度控制,特別是在優化過程中(圖3A)。

  • 獨立金屬模塊的絕熱性阻止了模塊之間的熱交換。 這就可實現更為精準的模塊溫度控制,確保模塊之間實現真正線性的溫度變化(圖3B)。

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3. 獲得準確的樣品溫度: 升降溫速度,維持時間及算法

 

PCR儀對于樣品溫度控制的能力對于PCR檢測結果的準確性和整體性能十分重要。 儀器特異性的參數如升降溫速度,維持時間以及算法對于預測樣品溫度(包括模塊溫度都是準確控制樣品溫度的關鍵。

 

PCR儀的升降溫速度意味著在一定時間內發生的PCR步驟之間的溫度變化,并通過用攝氏度每秒(°C/sec)作為單位。 相應的“升溫”和“降溫”分別代表著熱模塊的加熱和冷卻過程。

 

由于熱量從模塊傳輸至樣品需要一定的時間,樣品實際的升降溫速度會較慢(相對于模塊)。 因此,對于變溫速度的定義需要進行區分和了解(圖4)。

 

  • 最大或峰值模塊升降溫速度代表在進行升降溫過程中非常小的一段時間內模塊可以達到的最快溫度變化。

  • 平均模塊升降溫速度代表在一段更長的時間內溫度變化的速度,對于PCR儀的速度會提供一種更具代表性的測量。

  • 最大樣品升降溫速度及平均樣品升降溫速度反映的是樣品實際獲得的溫度。 因此,樣品升降溫速度會為PCR儀的性能以及其對于PCR結果的潛在影響提供一種更為準確的比較。



由于PCR儀的升降溫速度會對PCR結果產生影響,當進行PCR儀更換時,推薦使用帶有可模擬之前模式升降溫速度程序的儀器以實現更為簡易的更換并對PCR的重復性產生最小的影響。

 

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圖 4. 模塊和樣品的升降溫速度 模塊的熱過沖可讓樣品更快達到期望的溫度。 橙色和藍色散點曲線描繪了在沒有模塊熱過沖的情況下模塊和樣品的溫度。

 

PCR儀應該被設計成只有樣品達到設置的溫度后才對相應的步驟開始計時。 這樣維持時間,或樣品維持在設定溫度的時間,將會與操作流程中要求的相應循環條件保持得更加準確。

 

PCR儀通常會使用復雜的數學算法來確保樣品可按照預設程序快速地達到設置的溫度。根據反應體系的體積以及所使用的PCR塑料耗材的厚度,算法可對樣品的溫度以及達到設置溫度所需的時間進行預測。 依靠這些算法,PCR儀在加熱或冷卻的過程中,通常會通過一個叫做熱模塊過沖或下沖的過程讓模塊溫度超出設定值。 這樣的設置可以確保樣品盡快達到設定的溫度,而自身不會發生過沖或下沖(圖4)。

 

4. 滿足不同實驗通量的靈活性及設計

 

在一定時間內可以在PCR儀內進行的反應數對于PCR實驗的效率十分重要。 可提升PCR儀通量的因素包括升降溫速度、熱模塊構造以及自動化平臺的整合。

 

PCR儀的升降溫速度代表了其達到設置溫度的速度。 升降溫速度越快,PCR運行的速度就會越快,也就是在一定時間內可以完成更多的實驗(圖5A)。 此外,使用可更快合成目標DNA的DNA聚合酶也可對高通量實驗進行加速(圖5B)。


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圖 5. PCR儀的升降溫速度以及DNA聚合酶的合成速度影響PCR運行時間。 (A) 升降溫速度越快,升降溫時間越短。 在較低的升降溫速度(如1–3°C/秒)時,PCR運行時間的影響更為顯著。 該案例中使用的均為假設值,循環時間指的是操作流程時間。 (B)使用具有更快合成速度的DNA聚合酶將會導致更短的循環時間和PCR運行時間。

 

PCR儀模塊的設計對于PCR實驗的設置也至關重要。 例如,可替換的模塊就可為每輪運行帶來樣品數量上的靈活性。 此外,具有可單獨控制的多個模塊的加熱模塊是在一臺PCR儀上同時運行不同PCR程序的理想選擇(圖6)。



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圖 6. 具有三種獨立可控模式的PCR儀模塊



對于自動化的高通量PCR,PCR儀應該可編程并兼容控制移液處理系統的軟件。 自動化系統是進行高通量PCR反應的理想選擇,因為其可以在幾乎沒有人為干預的情況下持續不斷地運行,因而將手工實驗設置所需的時間最小化,并提高在一定時間內可反應的數量。

 

因此,對于比較簡易而靈活的自動化平臺進行整合的需求是存在的,從而實現移液處理或板堆疊的完全自動化操作。

 

5. PCR儀的可靠性,耐久性及質量保證

 

除了性能和通量能力外,PCR儀也應當能夠承受一定的重復使用、環境壓力以及運輸條件。 一些生產廠商可能會對儀器如何進行可靠性和耐久性的檢測進行過報道。 相應的PCR儀檢測包括:

 

  • 組件可靠性: 機械裝備會被用于對經常使用的儀器組件如熱蓋、控制面板/觸摸屏以及溫度循環模塊進行重復的測試(圖7A)。

  • 環境壓力: 可使用環境艙來模擬常規實驗的不同條件,如溫度、濕度以及海拔(圖7B)。

  • 運輸檢測: 可根據國際安全運輸協會(ISTA)標準進行激烈的沖擊和振動檢測,以確保儀器可在無受損的工作條件下運達(圖7C)。

 

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圖 7. PCR儀的耐久性測試。



6. 維護PCR儀的質保和服務

 

盡管有嚴格的可靠性和耐久性測試,PCR儀在儀器的使用壽命周期內仍然不可避免地會存在技術性問題。 為了消除后顧之憂,在進行購買儀器時應該考慮由生產廠商所提供的質保、服務和維護。 需了解:

 

  • 服務的靈活性如上門/返廠維修,遠程監控服務,維修過程中的替代儀器等,來最大降低對于工作效率的影響。

  • 質保期的長短,服務的周轉時間,技術支持的可接觸度,以及專業支持人員的技能和知識。

  • 儀器安裝、操作、合作、驗證的可行性來滿足實驗室和相關規定的要求

  • 可獲取如溫度驗證、檢測、校準和清洗的維護服務以確保儀器正常發揮相應的參數性能

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總之,PCR儀的特點如性能、設計、可靠性以及可獲得的支持和服務,是選擇PCR儀器需要考慮的重要因素。

 

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