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融解曲線中那些令你頭疼的問題,全面解析看這里!

融解曲線中那些令你頭疼的問題,全面解析看這里!

我們在做染料法 SYBR Green qPCR時,除了要看擴增曲線的CT值大小外,另一個重要的指標是融解曲線是否為單峰。那您知道融解曲線是怎么來的嗎?為什么說它是染料法 SYBR Green qPCR的重要指標之一呢?我們現在就來一起了解一下。

 01,什么是融解曲線

要明確融解曲線的重要性,我們需要先知道染料法 SYBR Green qPCR的化學原理。

染料法 SYBR Green qPCR的體系中添加了一種DNA雙鏈小溝結合染料, 即SYBR Green。它與DNA結合時發光,游離時不發光,所以每形成一條DNA雙鏈,就會有一定數量的染料結合上去,就會產生熒光信號,信號強度與DNA分子總數目成正比。

但是SYBR Green 只是識別DNA 雙鏈的小溝結構,當qPCR體系中存在非特異性產物時,SYBR Green 同樣可以和這些非特異性產物的DNA雙鏈結合發出熒光。所以儀器檢測到的熒光值其實為qPCR目的產物與非特異性產物熒光值的總和,那得到的CT值自然是不準確的了。所以使用染料法qPCR,前提為qPCR擴增體系一定要特異。

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qPCR擴增結束后,將溫度逐漸升高至95℃,DNA雙鏈也逐步解離為單鏈,DNA小溝結構逐步消失,SYBR Green 從雙鏈中游離出來,熒光值降低。當溫度達到 DNA 解鏈一半的溫度時,也就是 Tm 值時,SYBR Green 會大量游離出來,熒光強度隨之會出現突然下降,直至為0。這個反應熒光值變化的曲線即為融解曲線。

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以ABI Q3軟件的融解曲線程序設置為例(參見上圖):所有的DNA單鏈在60℃下完全退火形成雙鏈后,溫度逐漸升高至95℃(升溫速度為0.15℃/sec),DNA雙鏈逐漸解鏈為單鏈。儀器檢測到該過程熒光信號的改變,即可得到融解曲線的熒光圖譜。

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逐漸升溫至95℃過程中,雙鏈逐漸打開,熒光值高度下降


上圖為擴增曲線與融解曲線的原始圖譜,橫坐標代表循環數,縱坐標代表熒光值。40個循環即為擴增曲線,40循環之后為融解曲線?梢看到隨著循環數增加,熒光值逐漸下降,當到達Tm值時,剩余雙鏈迅速解開,熒光值迅速降低至0。




但我們平時看到的融解曲線是下面的這張圖譜。它是由融解曲線原始圖譜上每個點取負倒數而得到的。其橫坐標表示溫度,最高峰值對應的橫坐標的溫度值,即為Tm值。如我們圖中所示的融解曲線的Tm值為87℃。

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02,融解曲線的作用是什么


融解曲線的Tm值是融解曲線中的重要參數,在使用同一qPCR試劑下,目標基因融解曲線的Tm值是由其產物長度與GC含量決定的。目標基因的qPCR產物長度越長、GC含量越高,Tm值越大。不同的qPCR產物因其長度與GC含量不同,它們的Tm值大小也不一樣。


如下圖所示,基因1 qPCR產物長度較基因2 qPCR產物短,那融解曲線表現出基因1的Tm值低于基因2的Tm值。

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同理,如果qPCR擴增體系不特異,出現一個非特異性擴增產物,那qPCR產物即由目的產物與非特異性產物共同構成,因兩者長度與GC含量不同,在融解曲線上會表現出兩個Tm值,即兩個波峰;若非特異性產物Tm值與目的條帶的Tm值接近,融解曲線可能出現寬峰。


例1:單峰-qPCR產物單一

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例2:雜峰/寬峰-qPCR產物不單一

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所以,通過判斷基因的融解曲線峰形是否為單一窄峰,即可判定該基因qPCR擴增體系是否特異。染料法熒光定量,基因的融解曲線必須為單峰,定量結果才為準確。


03,如何去除融解曲線的雜峰

① 引物:如果引物設計不優,如引物設計軟件得出的引物評分較低、引物擴增效率不滿足90-110%,主要原因可能是引物本身質量不佳導致體系出現非特異性擴增。

解決方案:

重新設計引物,選擇引物設計軟件評分較高的2-3對引物進行合成,之后選擇融解曲線無雜峰,擴增效率滿足90-110%,且最接近100%的引物作為該基因的引物。

若該雜峰為引物二聚體引起,適當降低引物的投入量可以有效抑制引物二聚體的產生。


② 模板:cDNA模板存在基因組污染。

解決方案:

設計跨內含子引物進而避免基因組污染帶來的干擾;或者選用帶有基因組清除的逆轉錄試劑盒,逆轉錄前對RNA中混有的基因組進行清除。

③ CT值偏大:CT值≥30,可能是由于基因本身表達量低、或者擴增效率不滿足90-110%而導致的基因CT值偏大。CT值較大的情況下,融解曲線容易出現雜峰。

解決方案:

如果基因擴增效率不滿足90-110%,需要重新設計引物。

如果引物擴增效率滿足90-110%,操作問題的前提下,CT≥30,說明基因本身的表達量很低,可以適當增加模板的投入量,若沒有改善,可以更換為探針法。



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