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做熒光定量PCR時, CT值在什么范圍內比較好?

在做熒光定量PCR時,有個很重要的概念,就是“CT”。有經驗的同學會根據CT值的范圍來初步判斷這個實驗結果是否合理。

 

那么,什么是CT值呢?

CT在什么范圍內比較好呢?

 

1,什么是CT?

CT,是Cycle Threshold的簡寫,一般譯為“循環閾值”(閾,讀音yù,外“門”內“或”,不要誤以為“閥”哦)。簡單說,這是一個臨界點。在這個點之前,熒光曲線是近乎“平”的,從這個點開始,熒光曲線忽然開始聳立起來(俗稱為“起飛”),進入了傳說中的“指數增長期”。不同樣品、不同基因的CT值有可能是不同的。而這個點所對應的循環數值,就是后來我們進行基因含量計算的重要依據。見下圖

640.webp.jpg

 

2,CT在什么范圍內比較好呢?

在熒光定量PCR實驗中常有一個內參基因作為你的目的基因的參照。這樣,你在結果中應該關注兩個CT值:

一是你的目的基因的CT值

二是內參基因的CT值

 

常見的熒光定量PCR實驗,循環數多半設定為40個。一般認為,CT值太大或者太小,都是不可信的。如果太小,比如小于10,則因為在此階段熒光讀值還不是很穩定,所以讀到的值有可能不準。如果太大,比如大于35,則反應的隨機性增大、三復孔間的誤差可能會比較大,而且有可能伴隨有非特異性產物的影響。

一般認為,內參基因的表達量比較高,通常遠大于目的基因。內參基因的CT值要大于10——接近于20,目的基因的CT在20幾到30左右(通常小于35),都是比較理想的范圍。這樣的CT值算出的結果是可信的。

 

如果你得到的CT值落在這個范圍之外,太大或太小,就要小心結果有可能不準。

 

— 解決方法 —


調整一下模板DNA的濃度,提高或者降低模板DNA的濃度,會相應改變CT值,最終使之處于一個合理的范圍內。這樣的結果才是可信的。見下圖

640.webp (1).jpg

 

順帶說一下:我們平時得到的CT值是儀器使用默認參數下給出的。實際上這些參數我們是可以人為進行調整的。

 

比如圖一和圖二中的閾值(即Threshold這條橫線)的高度,在軟件中其實是可以手動調節的。個別情況下有可能需要這樣的操作。這樣得出的CT值就會略有不同。當然,如果你的實驗結果比較精確的話,這樣的調整并不會改變目的基因與內參基因的相對關系,所以最終算出的結果——即相對趨勢——并不會有本質上的變化。


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