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做熒光定量PCR實驗時, RQ值的計算方法?


什么是RQ值



RQ值(Relative Quantification),

即相對定量值,是在處理熒光定量PCR結果時對于某基因的相對表達量的簡稱。有時也會寫為Fold Change,即倍數變化,含義是類似的。


在做熒光定量結果處理的時候,相信大家都知道“∆∆Ct”這個有點拗口的說法。一般來講,這個說法基本都是這樣的:

圖片

RQ = 2^(-∆∆Ct)

∆Ct = 未處理過的樣品的目的基因Ct值 - 未處理過的樣品的內參基因Ct值         

∆∆Ct (處理1)= (處理1的樣品的目的基因Ct值 - 處理1的樣品的內參基因Ct值)-(3個∆Ct的平均值)

∆∆Ct (處理2)= (處理2的樣品的目的基因Ct值 - 處理2的樣品的內參基因Ct值)-(3個∆Ct的平均值)

……


看起來有點暈,是吧?當然你擅長數學的話,應該沒問題。但我們是學生物的……

沒關系,這里我們給大家提供一個簡明易懂的表述方式!


算法1

對于指定某個目的基因在第N天的表達量是第0天的多少倍(默認第0天的表達量為1,無單位),計算方法如下:

1.jpg

其中,Ef即為擴增效率(Efficiency)。在相對定量PCR中,理想的目的基因與內參基因的擴增效率是一致的。所以上下兩個Ef是相等的,可以約掉,不必考慮。


算法2

對于在同一個時間點,檢測基因B的表達量是基因A的多少倍,計算方法如下:

2.jpg

其中,公式中每個CT值都是3個孔的平均值。具體每孔的Ct值可在PCR數據結果中找到。一般在計算過程中先將3孔的CT值平均后再代入公式進行計算也是可以。


其他情況,如“同一基因在不同組織中的相對表達量情況”“同一基因在同一組織中經不同處理方法后的相對表達量情況”等等,邏輯上其實都是一樣的,所以算法也是類似的。


注意這種算法,一般都要求除了內參基因外,在你的幾組樣品中要指定某中某一組做為對照組,才能進行計算。所以用這種算法算出來的對照組的RQ一定是等于1的。如果你在后期分析時想要更改對照組,那么在處理數據時就也要做相應的修改。


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