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熒光定量 PCR 要點解析

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一、熒光定量 PCR 原理


熒光定量 PCR(Real-time PCR),是指在 PCR 擴增反應體系中加入熒光基團,通過對擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。


以探針法熒光定量 PCR 為例:PCR 擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,該探針兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。開始時,探針完整地結合在 DNA 任意一條單鏈上,報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收,檢測不到熒光信號;PCR 擴增時,Taq 酶將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監測系統可接收到熒光信號,即每擴增一條 DNA 鏈,就有一個熒光分子形成,實現了熒光信號的累積與 PCR 產物形成完全同步。


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傳統的 PCR 進行檢測時,擴增反應后需要進行染色處理及電泳分離,并且只能作定性分析,不能準確定量,易造成污染出現假陽性,使其應用受到限制。實時定量 PCR 技術不僅實現了對模板的定量,且具有靈敏度高、特異性和可靠性更好、自動化程度高和無污染的特點,使得熒光定量 PCR 逐漸取代常規 PCR。 


在 PCR 擴增反應的最初數個循環里,熒光信號變化不大,接近一條直線,這樣的直線即是基線,這條線是可以自動生成也可以手動設置的。之后反應會進入指數增長期,這個期間擴增曲線具有高度重復性,在該期間,可設定一條熒光閾值線,它可以設定在熒光信號指數擴增階段任意位置上,但一般會將熒光閾值的缺省設置是 3-15 個循環的熒光信號的標準偏差的 10 倍。每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數被稱為 CT 值,這個值與起始濃度的對數成線性關系,且該值具有重現性。



Ct 值最大的意義就是用來計算目的基因的表達量,此時就有兩個概念容易被提及,那就是絕對定量和相對定量,絕對定量的目的是測定目的基因在樣本中的分子數目,即通常所說的拷貝數。相對定量的目的是測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例,而不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數。


Ct 值誠然可以被利用來計算這兩種定量結果,但是絕對定量實驗必須使用已知拷貝數的絕對標準品,必須做標準曲線。相對定量可以做標準曲線,也可以不做標準曲線。絕對標準品制作困難難以獲取,實驗室基本都是選擇相對定量的方法來計算相對基因表達量。

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二、熒光定量 PCR 中的對照


對照的目的是對檢測的各個環節進行監控,因此我們按照檢測的流程對對照進行梳理。常規熒光定量 PCR 的流程是:樣品采集 - 運輸 - 樣品處理 - 核酸提取 - 反轉錄(RNA 病毒)- 擴增 - 結果讀取。

下面看看各個環節都可以使用哪些對照?

1. 陽性對照和陰性對照
陽性對照和陰性對照是指在相同的處理條件下,比如一份已知的感染樣品和一份已知的未感染樣品,都進行了提取和擴增最終獲得了陽性結果和陰性結果。陰陽性對照強調處理過程與樣品一致,并且有明確的預期結果。

2. 擴增對照
我們通常說的陽性對照和陰性對照指的是擴增試劑盒中附帶的不需要提取的陽性對照和陰性對照,更準確的定義應該是擴增陽性對照和擴增陰性對照。擴增陽性對照含有陽性擴增模板,擴增陰性對照應含有陰性擴增模板(基質核酸)。擴增對照只能監控每次擴增過程中的擴增系統是否正常,不能監控采樣、提取和每份樣品的操作過程。如果是檢測 RNA 樣品的檢測試劑盒,其擴增陽性對照使用質粒,便無法監控反轉錄過程。

3. 內標(Internal Control,IC)
內標是指在同一反應管中與靶序列共同擴增的一段非靶序列分子。內標有兩種形式,一種是使用天然樣品中含有的內參基因作為內標,另一種是人工添加的內標。內標的最大特點是與靶序列共同擴增,而其他的對照都是獨立擴增。

內參基因
通常它們在各組織和細胞中的表達相對恒定,在檢測基因的表達水平變化時常用它來做參照物。內參基因通常是持家基因(house-keeping gene)因為其表達水平受環境因素影響較小,而且在個體各個生長階段的幾乎全部組織中持續表達變化很小。常用的內參基因包括 GAPDH、β-actin (BETA-actin)、18sRNA、B2M、HPRT 和 TBP 等。

內參基因的優點是與樣品中的靶基因經歷完全相同的處理程序,可以監控采樣,運輸,核酸提取和擴增的全部過程。缺點是不同物種,不同生理狀態下,不同組織中的內參基因存在一定的差異。如果樣品類型是口腔液,咽拭子等樣品,內參基因的量很低可能導致實驗不成立。如果檢測的是環境樣品則內參基因可能完全失效。

人工內標
添加一種不會干擾靶序列擴增的人工合成的內標,F在國外的診斷試劑盒大部分都會將內標直接添加在反應液中與模板一起擴增,但是這樣的內標不能監控采樣,運輸和核酸提取的過程。

還有另一種形式的內標,使用人工合成的假病毒,在核酸提取前在每一份樣品中加入等量的內標,這樣就可以監控樣品的提取到擴增的過程。但是由于是人工添加到樣品中,仍然不能監控胞內細菌病毒的釋放情況。

4. 核酸提取對照
可以使用內參基因,假病毒混合基質,滅活病毒混合基質來監控提取到擴增的流程。

5. 反轉錄對照(RT control)
可以使用提取好的 RNA 內參基因,RNA 假病毒混合基質,滅活 RNA 病毒混合基質來監控反轉錄到擴增的流程。

無反轉錄對照(no-RT control)含有除反轉錄酶以外的所有成分。

6. 空白對照(Blank control)

無模板空白對照
NTC 是指不含有模板(陽性模板或者陰性模板)的對照。目前的試劑盒的 NC 一般都是水或陰性緩沖液,所以 NC 等同于 NTC。其實兩者有不同的作用。

儀器空白對照
NTC 是含有引物探針和反應液主要監控引物探針,反應體系有沒有被污染。這里的儀器空白對照我通常使用的是空反應管來監控儀器有無非特異性的熒光信號。

熒光染料對照
最常使用的是 ROX 染料,由于熒光定量 PCR 的熒光信號在每個樣品孔會有微小的差異所以使用特定的 ROX 熒光染料,系統可以根據 ROX 熒光染料的信號值來校準每孔的熒光信號。

7. 質控品(Quality control, QC)

上述環節中使用的各種對照大部分是試劑廠家匹配試劑盒使用的產品,有的是實驗室自制,所以整個的監控過程可能存在不夠客觀和獨立。因此在實驗室的對照設置中每次檢測都建議使用第三方質控品,有條件的使用國家有證標準物質 (Reference material ,RM)。由于標準物質具有準確量值和計量溯源性,可以更準確的評估整個試驗流程的準確度。

8. 定值參考品

醫學上的定量檢測試劑盒,需要配套定值參考品用于試劑盒的定量檢測使用。

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三、對照的選擇


從上文可知沒有一種對照是完美的,在檢測中我們要根據自己的需求來進行靈活選擇和搭配。筆者建議每一次檢測時添加一個能對從提取到擴增環節進行監控的質控品或標準物質;每份檢測樣品中添加內標(如果樣品種類比較多樣建議使用人工內標,如果樣品類型為相對固定的動物組織建議使用內參基因);擴增陽性對照,擴增陰性對照,無模板對照和 ROX 對照。有條件的添加臨床陽性對照和臨床陰性對照,在懷疑提取環節或者反轉錄環節出現問題時使用核酸提取對照和反轉錄對照。不定期使用儀器空白對照。

陽性對照與污染

不可否認的一個事實是陽性對照可以增加實驗室污染的風險。這種污染的來源一種是直接來源于擴增陽性對照的污染。對于擴增陽性對照來說通常 10000 拷貝 / 微升(CT 值約 25)是比較理想的,但是有一些試劑盒廠家的擴增陽性對照設置在 CT 值 20 以下,比大部分陽性樣本都強。這么高濃度的對照給實驗室帶來了巨大的污染風險,原因可能僅僅是因為試劑廠家擔心其陽性對照不穩定,長時間存放陽性對照降解。另一種污染來自于擴增產物的處理不當,或者實驗室的設計布局不合理。

初篩和確診

對照與實驗目的的關系好像從來沒有人提及過。根據筆者多年在檢測實驗室的經驗,分享一點個人的心得,歡迎大家批評指正。

對于初篩實驗,我們希望提高真陽性檢出率,即提高診斷敏感性。我們需要檢測系統達到最高檢測效率,因此要在不同環節添加陽性對照,確保每個環節的檢測效率最高。

對于確診實驗,我們希望提高真陰性檢出率,即提高診斷特異性。我們需要確保檢測系統不出現假陽性,因此要在不同環節添加陰性對照,減少非必須的陽性對照,甚至要在樣品盤的不同位置中隨機插入幾個陰性對照,確保實驗過程中沒有被污染。

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四、熒光定量 PCR 的應用


分子生物學研究 

1 核酸定量分析 對傳染性疾病進行定量定性分析,病原微生物或病毒含量的檢測,比如近期流行的甲型 H1N1 流感, 轉基因動植物基因拷貝數的檢測,RNAi 基因失活率的檢測等。

2 基因表達差異分析 比較經過不同處理樣本之間特定基因的表達差異 (如藥物處理、物理處理、化學處理等) ,特定基因在不同時相的表達差異以及 cDNA 芯片或差顯結果的確證 

3 SNP 檢測 檢測單核苷酸多態性對于研究個體對不同疾病的易感性或者個體對特定藥物的不同反應有著重要的意義,因分子信標結構的巧妙性,一旦 SNP 的序列信息是已知的,采用這種技術進行高通量的 SNP 檢測將會變得簡單而準確。

4 甲基化檢測 甲基化同人類的許多疾病有關,特別是癌癥, Laird 報道了一種稱作 Methylight 的技術,在擴增之前先處理 DNA ,使得未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不受影響,用特異性的引物和 Taqman 探針來區分甲基化和非甲基化的 DNA ,這種方法不僅方便而且靈敏度更高。

5 產前診斷 人們對遺傳性物質改變引起的遺傳性疾病還無法治療,到目前為止,還只能只能通過產前監測,減少病嬰出生,以防止各類遺傳性疾病的發生,如為減少 X 連鎖遺傳病患兒的出生,從孕婦的外周血中分離胎兒 DNA,用實時熒光定量 PCR 檢測其 Y 性別決定區基因是一種無創傷性的方法,易為孕婦所接受。

6 病原體檢測 采用熒光定量 PCR 檢測技術可以對淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、 結核分枝桿菌、EB 病毒和巨細胞病毒等病原體進行定量測定。與傳統的檢測方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡便等優點。

7 藥物療效考核 對乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV) 定量分析顯示:病毒量與某些藥物的療效關系。HCV 高水平表達,干擾素治療作用不敏感,而 HCV 低滴度,干擾素作用敏感;在拉米夫定治療過程中,HBV- DNA 的血清含量曾有下降,隨后若再度上升或超出以前水平,則提示病毒發生變異。

8 腫瘤基因檢測 盡管腫瘤發病的機理尚未清楚,但相關基因發生突變是致癌性轉變的根本原因已被廣泛接受。癌基因的表達增加和突變,在許多腫瘤早期就可以出 現。實時熒光定量 PCR 不但能有效地檢測到基因的突變,而且可以準確檢測癌基因的表達量。目前用此方法進行過端粒酶 hTERT 基因、慢性粒細胞性白血病 WT1 基因、腫瘤 ER 基因、前列腺癌 PSM 基因、腫瘤相關的病毒基因等多種基因的表達檢測。

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