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如何預防和處理PCR檢測實驗室的核酸污染?

核酸檢測實驗室想完全杜絕核酸污染是不可能的。核酸檢測實驗室的管理者和實驗人員必須要認識到核酸污染是不可避免的,但是污染的頻率和概率是可控的。我們要做的是時刻保持警惕,盡最大努力將污染的概率降到最低,并且能第一時間發現污染并及時進行處理。


先說說有史以來影響最大的實驗室核酸污染事件

當地時間4月18日,《華盛頓郵報》(Washington Post)爆了一則重磅新聞,美國CDC在實驗室生產的新冠病毒檢測試劑出現了污染問題,導致全美的核酸檢測推遲最少一個月。1月21日,CDC已經“確定開發”了新冠病毒的檢測方法,并使用它來確認美國的第一例新冠病例,1月下旬,美國CDC對26個公共衛生實驗室發放新冠病毒試劑盒,有24個實驗室出現了假陽性反應。CDC緊急召回了診斷試劑,直到3月2日,CDC的新冠病毒試劑由Integrated DNA Technologies,IDT公司生產重新投入使用。這起實驗室污染的代價是美國錯過了黃金的疫情防控窗口,數萬甚至數十萬普通民眾死亡。每一個實驗室都應該把這個教訓銘記在心,時刻提醒自己,核酸污染隨時都可能發生,無論什么級別的實驗室都可能發生。


核酸污染的預防措施

1.實驗室布局

核酸檢測實驗室的布局是預防污染的根本,合理布局可以大大降低污染的概率。一般情況分為四個區分別為試劑準備區,標本制備區、核酸擴增區和產物分析區。對于不需要電泳的熒光定量PCR,核酸擴增區和產物分析區可以合并。每個區應獨立通風,可控制空氣流動方向。

图片

(圖片來自《實時熒光PCR技術》)

有些核酸檢測實驗室在實驗室建設時未考慮到核酸擴增需求,就是按照普通實驗室建設。這種情況下,個人建議擴增和產物分析區應遠離試劑準備區和標本制備區,盡量不在一個樓層或者不在一個區域。最忌諱的是幾個實驗室緊挨著,甚至門對門。

另外建議廢棄物處理的房間也要遠離以上實驗室,避免廢棄物處理過程中產生的污染。


2.每個區域的物品專用

四個隔開的工作區域中每一區域都須有專用的儀器設備。各區域都必須有明確的標記,以避免設備物品如加樣器或試劑等從其各自的區域內移出從而造成不同的工作區域間設備物品發生混淆。在不同的工作區域應使用不同顏色或有明顯區別標志的工作服,以便于鑒別。


3.人流物流單向流動

進入各個工作區域必須嚴格遵循單一方向順序,即只能從試劑貯存和準備區、標本制備區、擴增反應混合物配制和擴增區(簡稱擴增區)至產物分析區,避免發生交叉污染。


4.人員培訓管理

再好的實驗室設計,如果實驗人員不遵守規程,一切都是徒勞的。加強實驗室人員的培訓和管理至關重要。


5.質控

陰性質控:實驗室的核酸污染風險跟檢測量正相關,因此在檢測活動比較頻繁時需要多添加陰性質控,包括陰性樣品,陰性提取對照,陰性擴增對照,無模板對照,甚至可以使用反應體系,引物探針和提取試劑等作為對照以檢驗檢測流程和反應系統組分的污染。陰性對照可以使用幾個隨機插入檢測樣品。保證出現污染可以第一時間發現。

陽性質控:避免或減少使用過強的質粒陽性對照。


6.PCR產物的處理

有一些規范建議PCR產物使用1mol/L鹽酸浸泡,我認為這極易造成PCR產物的暴露和擴散,具有很高的風險。還有一些實驗室從生物安全的角度將所有的實驗廢棄物全部高壓,我也是不建議的,因為PCR產物沒有生物安全風險,高壓會造成PCR產物擴散,對實驗室的污染風險更高。個人建議對于PCR產物,進行表面消毒后按照普通醫療廢棄物處理即可。


7.檢測方法的選擇

對于一般的核酸檢測實驗室,推薦使用封閉擴增的熒光定量PCR方法進行核酸檢測。不推薦使用普通PCR方法和巢氏PCR,使用這兩種方法實驗室污染是大概率事件。謹慎使用等溫擴增的方法,等溫擴增的酶反應效率更高,產物中模板含量也更高,污染的概率也會提高。


8.實驗操作

操作核酸時動作要輕柔,移液器吸液慢吸慢放,開管蓋要慢慢開,避免操作產生氣溶膠。使用渦動混勻后,稍稍靜置一會再開管蓋,推薦使用移液器緩慢吹吸混勻。


9含尿嘧啶糖苷酶(UNG)試劑的使

其原理是用dUTP 代替dTTP,使產物中摻入大量dU。在再次進行PCR 擴增前,用UNG 處理PCR 混合液即可消除PCR 產物的殘留污染。由于UNG 在PCR 循環中的變性一步便可被滅活,因此不會影響含dU 的新的PCR 產物。


10.試劑耗材要求

所有試驗物品盡可能分裝成小包裝:耗材開包后分裝成一周使用量,用自封袋封好。試劑也盡可能購買小包裝或者回實驗室分裝,實驗中經常用到配液的水尤其需要分裝。實驗中所有吸頭都應使用帶濾芯的吸頭。


核酸污染的處理措施

發現污染第一步就是要暫停實驗,評估假陽性對以往檢測結果的影響。對實驗進行徹底打掃和清理,盡可能更換相關的試劑耗材,對儀器設備進行清潔和去核酸處理。所有人員回家洗澡換衣服。


1.化學處理法

使用商品化的DNA去除劑,有好用的DNA去除劑大家可以推薦給我

mol/l的 鹽酸和各種化學物質去降解DNA。

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(圖片來自《實時熒光PCR技術》)

2.物理處理法

使用紫外燈照射。


3.佛系處理法

停下所有實驗,靠風和時間抹掉核酸的痕跡。這是我最常用的方法,通風是最有效的方式。


4.偷天換日法

如果是擴增產物污染,在不去除污染的情況下仍然可以進行檢測。方法是使用另一種方法或試劑盒,只要兩種試劑的擴增產物不一致,沒有交叉反應,仍然可以繼續試驗。但是這種方法要進行測試,我并不推薦這么做。


核酸污染處理的難點

1.移液器

移液器內部被污染很難去除,可以通過清洗或者換一套移液器。


2.生物安全柜

移除內部所有物品,用DNA去除劑擦拭表面后,打開門連續運行。


3.核酸提取儀內部

用DNA去除劑擦拭內表面后,打開提取儀門或外罩,靜置。


如果能及時發現污染,通常情況不會太嚴重,采取上述措施實驗室空置幾天污染會消除。但是如果發生了很嚴重的污染,采取上述措施污染仍不能消除,就只能把一切交給時間了。




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