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細說Western Blot

时间:2020-06-04     【原创】   阅读

與Southern或Northern雜交方法類似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳,被檢測物是蛋白質,“探針”是抗體,“顯色”用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品,轉移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上,固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質,且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原,與對應的抗體起免疫反應,再與酶或同位素標記的第二抗體起反應,經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。既可以定性,又可以半定量的Western是初步鑒定蛋白質最方便也是最通用的方法。

western顯色的方法主要有以下幾種:

1)放射自顯影

2)底物化學發光ECL

3)底物熒光ECF

4)底物DAB呈色

           現常用的有底物化學發光ECL和底物DAB呈色,體同水平和實驗條件的是用第一種方法,目前發表文章通常是用底物化學發光ECL。只要買現成的試劑盒就行,操作也比較簡單,原理如下(二抗用HRP標記):反應底物為過氧化物+魯米諾,如遇到HRP,即發光,可使膠片曝光,就可洗出條帶。

操作步驟(一)  配膠

        1)注意一定要將玻璃板洗凈,最后用ddH2O沖洗,將與膠接觸的一面向下傾斜置于干凈的紙巾晾干。

          分離膠及濃縮膠均可事先配好(除AP及TEMED外),過濾后作為儲存液避光存放于4℃,可至少存放1個月,臨用前取出室溫平衡(否則凝膠過程產生的熱量會使低溫時溶解于儲存液中的氣體析出而導致氣泡,有條件者可真空抽吸3分鐘),加入10%AP(0.7~0.8:100, 分離膠濃度越高AP濃度越低,15%的分離膠可用到0.5:100)及TEMED(分離膠用0.4:1000, 15%的可到0.3:1000,濃縮膠用0.8:1000)即可,如室溫較低可升高10%AP及TEMED濃度到《分子克隆》建議濃度。

          2)灌入2/3的分離膠后應立即封膠,膠濃度<10%時可用0.1%的SDS封,濃度>10%時用水飽和的異丁醇或異戊醇,也可以用0.1%的SDS。封膠后切記,勿動。

    待膠凝后將封膠液倒掉,如用醇封膠需用大量清水及ddH2O沖洗干凈,然后加少量0.1%的SDS,目的是通過降低張力清除殘留水滴。片刻后倒掉SDS,將玻璃板倒立放置片刻控凈。

         3)灌好濃縮膠后1h拔除梳子,注意在拔除梳子時宜邊加水邊拔,以免有氣泡進入梳孔使梳孔變形。撥出梳子后用ddH2O沖洗膠孔兩遍以去除殘膠,隨后用0.1%的SDS封膠。若上樣孔有變形,可用適當粗細的針頭撥正;若變形嚴重,可在去除殘膠后用較薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上樣,長時間有利于膠結構的形成,因為肉眼觀的膠凝時其內部分子的排列尚未完成。(10%的AP最好現配現用,如在4℃存放勿超過兩周。30%的丙烯酰胺如有沉淀,最好棄掉.)


(二) 樣品處理

1.培養的細胞(定性):

  ⑴去培養液后用溫的PBS沖洗2~3遍(冷的PBS有可能使細胞脫落)。

  ⑵對于6孔板來說每孔加200~300μl,60~80℃的1×loadingbuffer。

  ⑶ 100℃,1min。

  ⑷用細胞刮刮下細胞后在EP管中煮沸10min,期間vortex2~3次。

  ⑸用干凈的針尖挑絲,如有團塊則將團塊棄掉,如果沒有團塊但有拉絲現象,則可以將EP管置于0℃后在14000~16000g離心2min,再次挑絲。若無團塊也無絲狀物但溶液有些粘稠,可通過使用1ml注射器反復抽吸來降低溶液粘滯度,便于上樣。

  ⑹待樣品恢復到室溫后上樣。

2.培養的細胞(定量):

⑴去培養液后用溫的PBS沖洗2~3遍(冷的PBS有可能使細胞脫落)。

⑵加入適量的冰預冷的裂解液后置于冰上10~20min。

⑶用細胞刮刮下細胞,收集在EP管后超聲(100~200w)3s,2次。

⑷ 12000g離心,4℃,2min。

⑸取少量上清進行定量。

⑹將所有蛋白樣品調至等濃度,充分混合沉淀后加loading buffer后直接上樣最好,剩余溶液(溶于1×loadingbuffer)可以低溫儲存,-70℃一個月,-20℃一周,4℃ 1~2天,每次上樣前98℃,3min。

3.組織:

  ⑴勻漿  對于心肝脾腎等組織可每50~100mg加1ml裂解液,肺100~200mg加1ml裂解液?墒謩踊螂妱觿驖{。注意盡量保持低溫,快速勻漿。

⑵ 12000g離心,4℃,2min。

⑶取少量上清進行定量。

⑷將所有蛋白樣品調至等濃度,充分混合沉淀加loading buffer后直接上樣最好,剩余溶液(溶于1×loadingbuffer)可以低溫儲存,-70℃一個月,-20℃一周,4℃ 1~2天,每次上樣前98℃,3min。(裂解液配方:Tris-Cl (pH7.4) 20mM,EDTA 1mM由于蛋白酶抑制劑可影響蛋白定量,且新鮮蛋白很少降解,故可不加,如加按建議比例即可。提取磷酸化的蛋白還需加Na3VO4 0.1mM及NaF 25mM)。

1×loading buffer配方:10% 甘油,50mM Tris·Cl (pH6.8),2% β-巰基醇,0.2~0.5‰溴酚藍,2%或5%的SDS。Buffer可配成2×~5×,注意SDS終濃度勿超過10%。對于心臟,肌肉等碎屑較多的組織可用5%的SDS,肝腎等組織2%即可。)

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