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【包邮】染料法支原體污染實時定量PCR試劑盒

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染料法支原體污染實時定量PCR試劑盒

Dye-quantitative Real-time PCR Kit for Mycoplasma contamination


貨號規格
Myco-qs-2020次反應
Myco-qs-5050次反應
Myco-qs-100100次反應


儲存:-20度,避光保存,有效期一年。避免反復凍融。

 

試劑盒特點:

1, 本試劑盒對柔膜菌綱(包括支原體、螺原體和無膽甾原體)有極強的特異性,與柔膜菌綱以外的其他基因組無交叉反應。

2, 本試劑盒靈敏度高,最低可檢出反應液中2-4個基因組。

3, 本試劑盒使用熱啟動的Taq酶,可抑制非特異性擴增,降低背景熒光。

4, 本試劑盒帶有陽性對照樣品(組分C),可用于檢驗試劑盒有效性,也可用于驗證待測樣品中是否含有PCR抑制劑。

5, 本試劑盒帶有ROX參比染料,幫助校正加樣誤差和管間差異。

 


商品說明

支原體(Mycoplasma)屬于柔膜菌(Mollicutes)綱,直徑約0.1-0.3 μm,具有變形能力,因此可以輕易穿過常規的0.22 μm無菌濾膜,是常見的動物細胞培養污染源。由于支原體體積太小,在光學顯微鏡下不可分辨,因此細胞常常在不知不覺中被污染。

目前的經典檢測方法是歐洲藥典(European Pharmacopeia)2.6.7規定的體外培養法,用特殊培養基對支原體進行培養,以此檢測污染情況。培養法的優點是檢測靈敏度高,缺點是耗時較長,最長的需要28天之久,而且受操作人員的技能水平影響較大,不同實驗室的檢測誤差較大。隨著生物制藥業的發展,很多生物制品保質期較短,因此需要一種快速、靈敏并且特異性強的支原體檢測方法。歐洲藥典因此接納了核酸檢測方法作為培養法的替代方案。定量PCR法可以在幾個小時內完成檢測,靈敏度與培養法相當,甚至更好。

本試劑盒以16S rRNA基因為靶點,設計了多對引物,可檢出大部分已知的支原體,以及部分螺原體和無膽甾原體,與親緣關系較近的革蘭氏陽性菌,如鏈球菌、梭菌、乳桿菌等,沒有交叉反應,在檢測范圍和特異性方面達到歐洲藥典的要求。歐洲藥典提及的所有支原體均在本試劑盒的檢測范圍內。靈敏度方面,最低檢測值可以達到每個反應2-4個基因組,在不考慮DNA提取損耗的情況下,達到歐洲藥典要求的10 CFU/mL的最低檢測值。

本試劑盒包含熱啟動Taq酶、dNTP(以UTP代替了TTP)、引物、陽性對照品、SYBR Green I染料、ROX染料,和用以防止殘余DNA污染的UDG(尿嘧啶-N-糖苷酶),用戶只需準備好DNA樣品即可使用。


注意事項:

1,     本產品僅限于科研使用,不作診斷用途。

2,     操作過程中應注意防范樣品之間的串聯污染。最好對工作區域進行劃分,將不同步驟,如DNA提取和PCR反應液的配制,分開在不同階段不同區域進行。使用無污染的一次性槍頭,最好是帶濾芯的槍頭。最好在通風區域操作,操作時須佩戴無粉塵手套。

3,     對于在584 nm附近可產生激發光的儀器(大部分使用鎢燈或鹵素燈作為光源的儀器,還有一些儀器專門配置了LED燈,可激發~584 nm光源),ROX的反應濃度為30-50 nM。對于不能在584 nm附近可產生激發光的儀器(大部分以激光為光源的儀器),ROX的反應濃度為300-500 nM。具體可參考儀器的使用手冊,下表僅供參考。


TypeqPCR system
50×ROX Reference Dye(300-500 nM)

Applied   Biosystems 7000/7700/7900HT/7300/7900HT Fast;

ABI Step One;ABI Step One Plus

500×ROX Reference Dye(30-50 nM)

Applied   Biosystems 7500/7500 Fast;Stratagene Mx3000P/Mx3005P/Mx4000;

MJ Research Chromo4;Opticon (II);Corbett Rotor Gene 3000

no ROX   Reference Dye

Thermal   Cycler Dice,Bio-Rad iQ5/CFX96/CFX384/Opticon,

Roche Lightcycler,Qiagen Rotor-Gene,

Eppendorf Mastercycler,Cepheid SmartCycler

  

相關小知識:

熱啟動Taq酶結合了特異性單克隆抗體的DNA聚合酶,在室溫下聚合酶活性被抗體抑制。在PCR循環的變性階段,抗體受熱被去除,聚合酶活性恢復,因此獲得“熱啟動”功能,可減少殘余DNA的污染,提高PCR擴增效率、靈敏度和目的片段產量。

SYBR Green I可以與DNA雙鏈的小溝結合,結合后在497nm激發光照射下產生520nm的發射光。未結合雙鏈DNA的SYBR Green I基本不產生熒光。因此可以根據熒光值的大小判斷溶液內DNA雙鏈的多寡,用于實時檢測PCR反應過程中產物的累積量。初始模板濃度越高,反應循環數越高,則雙鏈DNA含量越高,熒光值也就越高。值得注意的是,SYBR Green I也可以結合非特異性PCR產物以及引物二聚體,此時產生的熒光與目標擴增產物無法區分。為了判斷熒光信號是否來自目標擴增產物,可以繪制熔解曲線。通過逐步緩慢升溫,使雙鏈DNA解離為單鏈DNA,同時檢測熒光值的變化,繪制曲線,根據熒光值觀察DNA解鏈的溫度。

UDG和dUTP可以阻止前次步驟殘余DNA的擴增。dUTP可以確保擴增后的DNA中均含有尿嘧啶。UDG可從單鏈或雙鏈DNA上去除尿嘧啶殘基,從而阻止含有尿嘧啶的DNA作為下幾輪PCR的模板。在PCR循環開始前的UDG孵育步驟,可以破壞帶有尿嘧啶的PCR產物。經過該去除污染步驟后,UDG在正常的PCR循環過程中被高溫滅活,對PCR反應沒有影響。

ROX不參與PCR反應,在PCR反應過程中熒光沒有變化,可以提供一條基線用于校正加樣誤差和管間差異,便于儀器自動分析報告熒光與內參ROX熒光的比值,使定量更準確。ROX染料的激發波長為584nm,發射波長為612nm。用ROX進行校正后可以使實驗誤差減小十倍左右。


相關產品:

支原體清除劑,貨號:Myco-E-h,Myco-E-1,Myco-E-5,產品鏈接:http://www.sjf8.com/products/18241498.html

支原體污染PCR檢測試劑盒,貨號:Myco-P-20,Myco-P-50,Myco-P-100,產品鏈接:http://www.sjf8.com/products/18241568.html

探針法支原體污染實時定量PCR試劑盒,貨號:Myco-qt-20,Myco-qt-50,Myco-qt-100;產品鏈接:http://www.sjf8.com/products/20766324.html


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